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BD Phosflow完整解决方案

点击次数:   更新时间: 2023-09-27 来源:半岛网页版入口官网/PO膜关闭
产品详情

  BD phosflow 技术是检测胞内蛋白磷酸化较早的商业流式解决方案。研究者能应用BD Phosflow 技术同时分析多种胞内磷酸化蛋白和细胞表面标记分子,进而得到各个群体细胞中信号转导的多种信息。

  将分离和分析一步完成,BD Phosflow 可以研究复杂的混合细胞。科学家可以在接近自然条件下监测细胞刺激因素的作用,减少在体外分析共有的时间差异。甚至稀少的细胞亚群,也可以在单个实验中鉴定和分析。

  BD Phosflow为不同细胞类型提供完整的方案和详细步骤,同时提供高质量的磷酸蛋白库和经过验证的细胞表面标记分子。

  IL-6对T细胞活性的影响。IL-6控制T细胞的增殖,存活和定向,并调节其效应细胞因子的产生。此处的示例强调了IL-6在维持T细胞应答(例如,控制TH1或TH2细胞的增殖和存活)中的支持作用,其中IL-6对于确定的效应子群体的发展至关重要。辅助性T细胞的TH17,TH22和TFH子集)或其抑制作用(例如Treg细胞)。IL-6还通过控制趋化因子受体的表达来调节T细胞浸润,并且作用于基质组织的IL-6反式信号传导可调节负责招募T细胞的几种炎症趋化因子。同源IL-6R表达主要与表达CCR7和CD62L的幼稚或中央记忆T细胞相关。T细胞抗原受体的激活促进IL-6受体的脱落,并伴随着IL-6介导的STAT1活性的丧失。IL-2的存在阻止了IL-6R在T细胞表面的呈递。这表明T细胞的活化导致T细胞对IL-6的应答性的改变以及从经典的IL-6R信号转为IL-6反信号转导。IL-6还可以修饰定义的T细胞群体的效应子特性。例如,IL-27和IL-6之间的信号相互作用(涉及STAT1和STAT3的激活)通过定义的效应T细胞亚群促进IL-10的分泌。

  在乳腺癌中,IL6 / STAT3信号转导与ER在功能上脱钩。IL6激活的STAT3通过选择共享的ER-FOXA1-STAT3增强子的一个子集来驱动独立于ER和FOXA1的独特转录程序,从而促进转移。这表明在ER +乳腺癌中靶向IL6 / STAT3的临床潜力。

  3.2. (选做步骤)因前处理过程对细胞信号通路有某些特定的程度的刺激,所以有些细胞需要在前处理完成后,在完全培养基中静息2-4小时,以保证细胞恢复到未受刺激状态(参见操作说明)。

  3.3. 用适当的刺激剂处理细胞,37°C 孵育适当的时间(1到30分钟,参见操作说明)。实验需设立未处理样本为阴性对照。。

  3.4. 刺激处理后,迅速加入相等量的、预热的细胞固定液。振荡器低速振荡混匀细胞。

  3.6. 600g 离心6-8分钟,弃上清,试管中残余液体量不多于50μL。

  3.7. 振荡器低速振荡混匀细胞。在破膜前细胞重悬不充分会导致细胞聚集。

  3.8.于1–10 x 10^6细胞中加入1ml (最少1ml)预冷的Perm Buffer II或 II进行细胞破膜。振荡器低速振荡混匀细胞,冰上孵育30分钟。

  b. 600g 离心6-8分钟,弃上清,试管中残余液体量不多于50μL。

  b. 600g 离心6-8分钟,弃上清,试管中残余液体量不多于50μL。

  3.1. 取小鼠组织样本(如脾脏,胸腺,骨髓等),用PBS或完全培养基制成单细胞悬液

  3.4. 以1–10 x 10^6 cells/mL的浓度将细胞重悬于PBS或完全培养液中。必要时可以用70μm 的滤器过滤去除细胞团块。

  3.5. (选做步骤)因前处理过程对细胞信号通路有某些特定的程度的刺激,所以有些细胞需要在前处理完成后,在完全培养基中静息2-4小时,以保证细胞恢复到未受刺激状态(参见操作说明)。

  3.6. 用适当的刺激剂处理细胞,37°C 孵育适当的时间(1到30分钟,参见操作说明)。实验需设立未处理样本为阴性对照。

  3.7. 刺激处理完毕后,迅速加入10倍体积的、预热的Lyse/Fix Buffer 裂解固定细胞。振荡器低速振荡混匀5-10次。

  9.胞内染色:按照适当比率用FACS staining buffer配制phosflow抗体,配制好的抗体重悬细胞,室温放置30分钟(冰上放置或37°C)。

  关于BD Phosflow检测,我们提议比较未刺激样本的基础磷酸化水平(阴性对照)与刺激样本的磷酸化水平,而不是相同样本中总蛋白与磷酸化蛋白的含量。然而某些情况下,研究人员可能会对某种特定蛋白的总量感兴趣 (比如,在此较不同的人肿瘤样本时,阴性对照是无法比较的)。咱们提供针对总蛋白的抗体 (如ERK, P38, AKT, Stat等等),但是目前尚不可以应用于BD Phosflow检测一般而言,识别总蛋白抗原表位的抗体未必能识别特异性的磷酸化位点。因此,任何标准的胞内染色流程应该适用于针对总蛋白的抗体。用于免疫荧光的抗体可能适用于流式细胞术。但请牢记,未经流式验证的抗体我们将不能保证结果的准确性,建议研究人员根据实验条件选择正真适合的试剂。

  3、BD Phosflow实验流程中,第一先考虑使用何种抗凝剂 ( EDTA或者肝素)?

  一般而言,EDTA与肝素无太大差异,我们未明确比较抗凝剂种类对不同实验操作的影响。然而对于激活条件需要Ca++存在的情况下肝素是最优选择。因为EDTA是一种螯合剂,它会使Ca++大幅度减少。而用PMA/离子等素刺激全血时,EDTA可以越来越好的分离单核细胞和粒细胞。

  4、用于BD Phosflow检测的全血样本在溶血后可以在-20℃~-80℃条件下长期保存吗?

  由于新鲜细胞再使用BD Phosflow抗体石的信噪比最大,我们从实验室研究人员处得知可先固定细胞、制备单细胞悬液(根据推荐的BD Phosflow操作流程),随后将细胞重悬于PBS中(不含多聚甲醛)并将细胞/PBS混悬物冻存于-80℃。此方法只能使样本保存十几天。请注意,此方法并没有被BD生物科学研发内部广泛验证,所以在BD Phosflow操作流程中推荐使用经红细胞裂解的全血样本。

  5、使用磷酸化的stat抗体时(p-Stat)推荐哪种 Phosflow操作流程?我在进行P-stat蛋白检测时经常染不上或者背景信号很高 。

  用于分离贴壁细胞的无蛋白酶溶液(用于BD Phosflow检测)是EDTA溶液或者一些商业化的产品(例如无酶分离液)。虽然有人声称这一些产品比自配的EDTA溶液效果好, 但无胰岛素溶液的效果仍然比不上含胰岛素的溶液。分离贴壁细胞,尤其是分离液中缺少胰岛素时,需要更长的孵育时间。另外,如果先激活细胞,然后分离用于流式细胞术检测,磷酸化信号可能很快就会消失。

  8、应用Perm Buffer III时保持细胞表面染色的最好方法是什么?

  很多情况下,用Perm BufferIII (Cat.No.558050)进行常规的固定/破膜操作会完全破坏某些表面抗原(例如CDl6,CD19,CD56和CDl4)的染色。我们已证实有部分细胞表面分子在磷酸化激活、细胞固定、表面染色,随后用Perm Buffer III破膜等一系列操作之后可保持 良好的染色效果(Validated Cell Surface Markers)。虽然表面染色的荧光强度会减弱(阴性群与阳性群的分离减弱)但仍能被检测到。已修改的实验操作经内部检测可适用于人CDl6,CDl4,CD19及CD56的标记。

  9、含洗涤剂与含甲醇的破膜剂(Perm buffers)在破膜效果上有什么差异?

  含洗涤剂的BD Perm/Wash buffers通常会保持蛋白的二级/三级结构的完整性。而含甲醇的Perm buffers会破坏结构的完整性。对于二聚体的Stat蛋白来说,这种破坏更为有利。但是对于磷酸化位点不结合其他任何物质的蛋白来说并不是必要的。

  12、用小鼠脾细胞进行BD Phsoflow操作时,常常要用到得细胞密度/细胞量是多少?

  根据试验的不同,我们会用4xl0^5/ml的细胞,2ml用于刺激。我们提议设定不同的时间点(例如5min,l0min,15min)以寻找最佳的刺激条件。

  由于许多磷酸酶抑制剂会激活细胞(磷酸酶抑制剂有时会用于细胞激活),我们不建议加入磷酸酶抑制剂来保持蛋白的磷酸化。细胞活化之后迅速用推荐的固定液固定细胞,这是保持蛋白磷酸化的重要步骤。

  通常我们会以刺激样本与未刺激样本平均荧光强度的比值来计算不同样本磷酸化水平改变的倍数

  对的,BD Phosflow抗体能够与转录因子、凋亡标记物(如分割的PARP等)。

  这取决于要检测的细胞类型。比如对于细胞系来说,一般收集5000个细胞就足够,但是对于相对稀少的细胞群体,如检测新鲜分离的PBMCs中的Treg细胞时,就需要收集更多的细胞量(50-100k)。切记在样本处理过程中(如洗脱)会损失部分细胞,而且我们得知细胞损失的程度恰恰与最初始的细胞量成反比,例如最初的细胞越少,损失的细胞就会越多。通常情况下每个样本我们最少准备250,000个细胞。

  18、用流式细胞术进行BD Phosflow染色时,我们收集的细胞数比Westem Blot少,同时就会有更少的目的细胞群,那么磷酸化检测的灵敏度如何保证呢?

  在流式细胞术中,一次只检测一个细胞。因此能够检测单个细胞水平的信号通路改变是BD phosflow的最大优势之一,因此也可用于检测混合细胞群体的异质性变化。这个优点就伴随着比其他检测的新方法如WB灵敏度低的缺点。但是有几点需要明确 : l) 部分Phosflow抗体的检测灵敏度与WB 致 (如p-stat3、5和p-stat6 )。2) Phosflow并不是来取代WB,而且补充WB 的不足。两种检测的新方法都有各自的优缺点。对于不同的研究课题要选择正真适合的研究工具。例如,运用WB检测珍贵样本 (尤其是复杂细胞群) 中信号通路是个繁冗、需要投入大量人力和大批样本量的过程。而在研究同质性的细胞群如细胞系的信号通路时. WB就是一个比较好的方法。

  Perm Buffer I:含中型洗涤液的Perm Buffer,适用于大多数的细胞表面标记,但对于一些磷酸化标记,如pStats不是最佳的选择;

  20、破膜固定的操作步骤会影响细胞表面标记的染色吗?如果会,应如何减少影响?

  通常抗体结合细胞表面标记是通过识别抗原表位实现的。固定/破膜的操作步骤会对抗原表位的结构产生一定的影响。因此,固定/破膜会对细胞表面染色造成不利影响。减少该影响的最好方法就是严格按照推荐的操作的过程进行(例如固定液浓度不高于推荐的使用浓度, 细胞固定破膜的时间不宜长于推荐时间,且温度不宜高于推荐温度)。另外,细胞经固定破膜后,活细胞表面染色的最佳抗体稀释度将有所改变,因此适当调整抗体稀释度将有利于提高检测灵敏度。

  两种实验方法的差异详见phosftow实验的优势与局限性说明。这两种实验的优势与劣势是互补的。

  5) 单细胞水平检测可排除细胞裂解所造成的检测数值均化,这为检测不均一样本中单个细胞蛋白信号提供了可能性;

  3) 样本必须是单个细胞悬液,但暂时不适用于实体组织和粘附细胞样本的检测;

  任何情况下我们均推荐使用一步染色法,因为该操作简易且工作量小。以下网站资源中有两份缓冲液兼容性资料能够指导客户在不同缓冲液条件下,经破膜固定的细胞怎么来实现细胞表面和胞内标记的共染。如果一步法染色无法正常工作。在BD和Cytobank网站上有两份可供选择的染色操作流程。

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